兔胚胎工程造价师

（四）蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）
蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质
蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。
基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）
设计中的困难：如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列

专题3 胚胎工程知识点总结
〖1 体内和早期胚胎发育〗
胚胎工程的建立
场所：丸的曲细精管
时间：从初情期开始，到生殖机能衰退
的发生 1）精原细胞→多个初级精母细胞（通过数次有丝）
过程 2）1个初级精母细胞→2个次级精母细胞→4个细胞（通过减数，即MI和MII）
3）细胞→（通过变形）
场所：巢
时间：从胎儿时期开始（胎儿时期完成了泡的形成和在巢内的储备）
子的发生 1）原细胞→初级母细胞
过程 2）1个初级母细胞→1个次级母细胞＋第一极体（排前后完成）
3）1个次级母细胞→1个子＋第二极体（和子结合过程中完成）
概念：和子结合成合子（）的过程。
场所：雌性的输管内
1）前的准备阶段1：获能
过程 2）受惊前的准备阶段2：子的准备
穿越放冠和透明带：顶体反应，透明带反应
3）阶段 进入黄膜：黄膜封闭作用
原核形成和配子结合
裂期：细胞在透明带中进行有丝
早期胚胎发育 桑椹胚：胚胎细胞达32个左右，每一个细胞都是细胞
囊胚：有囊胚腔，出现了囊胚从透明带中伸展出来的孵化过程
原肠胚：内细胞团细胞形成外胚层和内胚层，滋养层发育成胎膜和胎盘，内胚层包围着原肠腔

〖2 体外和早期胚胎培养〗
试管动物技术：通过人工操作使子和在体外条件下成熟和，并通过培养发育为早期胚胎后，
再经移植产生后代的技术。
方法一：用促性腺激素处理，使其超数排，从中输管冲取（针对
母细胞的采集 实验动物，家猪、羊等）
方法二：从屠宰母巢中采集
方法三：借助超声波探测仪、内窥镜、腹腔镜等工具直接从活体母
巢中吸取（针对大家或大型动物，如牛）
体外 母细胞的培养：在体外人工培养成熟
的采集：方法有假法、手握法和电刺激法等
的获能：方法有培养法（通过获能培养液）、化学诱导法（通过肝素或钙离子载体A23187）
获能溶液或专用的溶液
：获能的 ＋培养成熟的子 完成
胚胎早期培养 条件：在发育培养液中培养
培养液成分：无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等

〖3 胚胎工程的应用及前景〗
概念：是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外及其他方式得到的胚胎，移植到
同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体叫供体，接受胚胎的个体叫受体。
应用：胚胎移植是转基因、核移植、或体外等技术的最后一道“工序”
现状：在牛的胚胎移植中，技术方法更为简便、实用。
意义：可充分发挥雌性优良个体繁殖潜力。供体主要职能只是产生优良特性的胚胎，缩短繁殖周期
胚胎移植成功与否关系到：供体和受体的生理状况
胚胎移植 1）供、受体官的生理变化相同，为胚胎提供相同的生理环境
生理学基础 2）早期胚胎没有与母体建立组织联系，为胚胎收集提供可能
3）受体对外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，为胚胎的存活提供可能
4）胚胎能与受体建立正常的生理和组织联系，但其遗传物质不受影响
1）供、受体的选择和处理（使用激素进行同期发情处理、超数排处理）
2）配种或人工
基本程序 3）胚胎收集（冲）、检查（胚胎发育到桑椹胚或囊胚）、培养或保存（－1℃的液氮）
4）胚胎移植：手术法（引出和巢将其注入）；非手术法（用移植管将其送入）
5）移植后的检查（是否妊娠）等
概念：指采用机械方法将早期胚胎切割成2、4或8等份等，经移植获得同双胎或多胎的技术。
仪器设备：实体显微镜和显微操作仪
操作程序 1）选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚，移入盛有操作液的培养皿
胚胎分割 2）用分割针或分割刀切开胚胎，吸出半个，注入空透明带或直接将半胚移植
给受体。分割囊胚时要将内细胞团均等分割。此时还可用分割针分割滋养层，
做胚胎DNA分析性别鉴定。
局限：刚出生的动物体重偏低，毛色和斑纹上存在差异，同多胎的可能性有限。

概念：由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。简称ES或EK细胞。
特点 形态上：体积小、细胞核大、核仁明显
功能上：具有发育的全能性，即可分化为成年动物体任何一种组织细胞；在体外可
胚胎干细胞 增殖而不发生分化；可冷冻保存；可进行遗传改造
1）移植ES细胞修复坏或退化部位，治愈糖病、肝(心)衰竭、成骨不良等病症
意义 2）ES细胞体外诱导分化，可培育人造组织器官
3）ES细胞在牛黄酸、丁酰环腺苷酸等诱导因子作用下可向不同类型组织细胞分化
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（一）动物胚胎发育的基本过程
1、胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。
2、动物胚胎发育的基本过程
（1）场所是母体的输管上段。
（2）裂期：特点：细胞有丝，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。
（3）桑椹胚：特点：胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。
（4）囊 胚：特点：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。
（5）原肠胚：特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。
（二）胚胎干细胞
1、哺动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。
2、具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
3、胚胎干细胞的主要用途是：
①可用于研究哺动物个体发生和发育规律；
②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；
③可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖病等；
④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏或退化的部位得以修复并恢复正常功能；
⑤随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。
（三）胚胎工程的应用
体外和胚胎的早期培养
(1)母细胞的采集和培养：
主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的子，然后，从输管中冲取子，直接与获能的在体外。第二种方法：从刚屠宰母的巢中采集母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的巢中吸取母细胞。采集的母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的。
(2) 的采集和获能：在体外前，要对进行获能处理。
(3) ：获能的和培养成熟的细胞在获能溶液或专用的溶液中完成过程。
(4)胚胎的早期培养：与子在体外后，应将移入发育培养液中继续培养，以检查状况和的发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外胚胎可在4个细胞阶段移植。)
胚胎移植
(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）
地位：如转基因、核移植，或体外等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。
(2) 胚胎移植的意义：大大缩短了供体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。
(3) 生理学基础：①动物发情排后，同种动物的供、受体官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。
③受体对移入的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。
④供体胚胎可与受体建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
(4) 基本程序主要包括：
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排处理。
②配种或人工授精。
③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲装置，把供体母牛内的胚胎冲洗出来(也叫冲)。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入－1℃的液氮中保存。
④对胚胎进行移植。
⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
胚胎分割
(1)概念：是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等，经移植获得同双胎或多胎的技术。
(2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。
(3)材料：发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至囊胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。）
(4)操作过程：对囊胚阶段的胚胎分割时，要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

有电脉冲刺激，但一般用激素法让其超数排，用细管和生理盐水冲。

胚胎的收集是利用冲液将胚胎由生殖道中冲出，并收集在器皿中。收集胚胎有两种方法，即手术法和非手术法，前者可用于各种家胚胎的收集，后者仅适用于牛、马等大家，且只能在胚胎进入角后收集。

收集胚胎时应考虑配种时间、排的大致时间、胚胎运行的速度和发育阶段等因素。只有这样才能顺利地完成胚胎的收集过程，并得到较高的胚胎回收率。各种家授精后胚胎发育的速度和运行情况见表。

胚胎收集的时间不应该早于排后的第一天，最早应在完成第一次裂之后，否则不易辨别子是否。收集时间一般在配种后的3～8天，牛最好是在配种后的6～8天，即胚胎发育至桑椹胚或者早期囊胚，以便非手术法收集和移植。

1．手术法收集胚胎 根据种的不同及外科手术的要求，在腹中线或腹侧作一切口，先将一侧输管及角移出腹腔，用注器吸取冲液注入输管或角内进行冲洗，并观察巢上的排情况。然后将该侧送回腹腔，并移出另一侧，用同样方法进行冲洗。

手术法冲洗胚胎有以下几种方式（图10－2）。一种方式是用注器的磨钝针头刺入角顶端，注入冲洗液，然后再输管的伞部接取冲液，这种方式适用于牛、羊、兔等。另一种方式冲洗的方向与此相反，即由伞部注入冲洗液，在角上端接取。猪和角与输管的接合部有一活塞结构，用第一种方式，冲洗液不易通过，因此多采用第二种方式。上述两种方式是当胚胎还处于输管时采用。当确认所有的胚胎都已进入角内时，可采用冲洗角的方式，即从角上端注入冲液，由基部接取，或者相反。这种方式适合于各种家。冲液用量以角容积大小而异。冲操作，要求迅速准确，以防止对伤口、官和冲液的污染，力求避免给动物带来刺激和对管造成损伤。一般来说，术后官容易发生不同程度的粘联，严重时会造成不孕，这是手术法收集胚胎最大的缺点。冲洗之后，应立即缝合伤口，母应单独饲养，并随时观察其伤口的愈合情况。
图：
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2．非手术法收集胚胎 牛、马也可采用非手术法收集胚胎，由于它比手术法简单易行，而且对官的伤害程度较小，因此在生产中较多采用此法(图10-3）。

图10-3、10－4：母牛非手术收集胚胎示意图：
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牛的非手术法收集胚胎可利用双通式或三通式导管冲器，其差别在于双通式采器冲液注入和流出是经同一管道完成的，而三通式采器冲液的注入和流出是经过两个不同的管道完成的。无论是双通式还是三通式，其外管前端均连接一气囊。当冲器入角内时，充气冲液流入体并沿着颈口流出。每侧角需冲液100～500ml。冲液的导出应顺畅迅速，并尽可能将冲液全部收回。为此，冲时最好用手在直肠内将角提高并略加按压，以利于冲液流出。胚胎的回收率与冲液回收的完全程度呈正相关。

应用非手术法收集胚胎时，只有当胚胎都进入角后方可进行。显然，这种方法无法收集停留在输管内的胚胎，因此，用非手术法收集牛、胚胎时，一般在配种后的6～8天进行。

收集胚胎的冲洗液有多种，主要有杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），布林斯特氏液，合成输管液（SOF），惠屯氏液，Ham’s F－110以及T－199，尤以D-PBS最常用。它们除含有多种盐外，还含有多种有机成分，不但可用于胚胎收集，还可用于胚胎体外培养，冷冻保存及解冻等。

收集胚胎的冲洗液可不含牛血清白蛋白，培养和保存时则需加入，或以胎犊血清代替。血清白蛋白的含量一般为3～1％，犊牛血清需在56℃时持续灭活30分钟，冲液、培养液中血清的含量一半分别为5％、10～20％。

13、基因工程产生的蛋白质是自然界已经存在的物质；而蛋白质工程生产的蛋白质是自然界没有的蛋白质。

27、细胞变形填空：（1）细胞核演变成头部的主要部分；（2）高尔基体发育为头部的顶体。（3）中心体演变的尾。（4）线粒体聚集在尾的基部形成线粒体鞘膜,同时其他物质浓缩为球状，叫做原生质滴，随着的成熟过程向后移动，直到最后脱落。
28、哺动物形成时间从动物的初情期开始的直到个体的机能衰退，子形成从时间和空间看是间断的不连续的，在胎儿期完成原细胞到初级母细胞，初情期后完成由初级母细胞到次级母细胞，后，次级母细胞才能完成减数第二次；哺动物形成的场所分别是精巢，哺动物子形成的场所是巢和输管。
29、哺动物与细胞的作用是在雌性的输管内完成，前，要在生殖道中获能，“细胞”也要作准备，只有“细胞”达到减数第二次中期时，才能发生作用。
30、哺动物过程主要包括三大阶段：穿越放冠和透明带、进入黄膜、原核形成和配子结合。
31、顶体反应是顶体释放顶体酶，溶解丘之间的物质。形成穿越放冠的通路。
32、透明带反应是当穿越放冠，进入透明带并接触黄膜时，会产生阻止后续的进入透明带的生理反应，这是防止多精入继而造成多的第一道防线。
33、黄膜封闭作用是当第一进入黄膜后，会立刻引起黄膜的紧缩、增厚、阻止其他进入黄膜内与子结合，是防止多的第二道防线。
34、进入子后,原核膜破裂，形成新核膜，形成雄原核，子被激活完成MⅡ，排出第二极体，形成雌原核。
35、在黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，这是判断子是否的重要标志。
36、动物胚胎发育的基本过程：（1）裂期细胞的特点是细胞有丝，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。（2）桑椹胚细胞的特点是胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹，该阶段前的细胞是全能细胞，每个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能。（3）囊胚细胞特点是细胞开始出现分化，聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织，沿着透明带内壁排列的较小、将来能发育成胎膜和胎盘的细胞为滋养层细胞，中间的空腔称为囊胚腔。（4）原肠胚期胚胎的特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。
37、胚胎移植是将雌性动物体内早期胚胎或通过体外及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。胚胎移植又是胚胎工程其它技术的最后一道“工序”。
38、胚胎移植的优势是可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，大大缩短了供体本身的繁殖周期。
39、胚胎移植基本程序主要包括：①对供、受体的选择的标准之一是供体和受体是同一物种，对供受体要进行的处理是用促性腺激素激素进行同期发情处理，并用促性腺激素对供体母牛做超数排处理。②配种或人工授精。③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲装置，把供体母牛内的早期胚胎冲洗出来(也叫冲)。
④对胚胎进行移植时应选择发育桑椹胚或囊胚进行移植。⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
40、胚胎分割的实质是无性繁殖或克隆，胚胎分割时的胚胎应发育到囊胚或桑椹胚，进行操作时，要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
41、胚胎干细胞来源于早期胚胎或原始性腺。胚胎干细胞的形态特点是体积小,细胞核大,核仁明显，功能特点是具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。

胚胎工程主要是对哺动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物的新技术。实际上是动物细胞工程的拓展与延伸。

胚胎分割，胚胎移植，胚胎干细胞